小动物PET及其在医药学研究中的应用
*j6Js'kw(e5w0摘要 小动物PET是一种无创伤性的分子影像学技术,是连接实验科学和临床科学的桥梁,在医药学研究中具有独特的价值。该文简要介绍小动物PET显像的优点与挑战、基本原理及小动物PET扫描仪的发展,并探讨小动物PET在医药学研究中潜在的应用价值。中国宠物医师网;~:wi8]'kh)w*R7NE
e(r.{ ` u/{0关键词 小动物PET;分子影像学;医药学研究3a+[/U)DD
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基因表达、基因治疗及药物研究需要活体内分子显像。分子显像是指在活体状态下在细胞和分子水平应用影像学对生物过程进行定性和定量研究[1],分子生物学与医学影像学相互交叉融合形成了分子影像学。分子影像学技术或分子显像技术主要包括磁共振(MR)分子显像技术、光学分子显像技术和核医学分子显像技术[1]。核医学分子显像技术包括单光子发射计算机断层(SPECT)显像和正电子发射断层(PET)显像,具有灵敏度高、可定量及动物实验结果可直接推广到临床等优点,是目前最成熟的分子显像技术,相比之下,PET显像技术最具发展前景。目前,PET技术在肿瘤学和神经科学中的价值已得到人们认可并显示出巨大应用前景;此外,随着基因组学的发展,小动物(如小鼠)在现代分子生物学实验中日趋重要。临床型PET已用于动物和人体研究,但受其空间分辨率的限制,很难满足小动物PET 显像的需要[2,3]。高分辨率小动物PET出现,增强了人们对小动物PET的兴趣,小动物PET成为分子显像的重要工具。'}6w y&p-i jq(m0
u9R*YW0C7~01 小动物PET显像的优点与挑战4W8G{w5_n)X$Gl(D.L0
e2VV?%\+`0PET与其他分子显像方法相比具有以下显著优点[4]:①PET可以动态地获得秒数量级的动力学资料,能够对生理和药理过程进行快速显像。②PET具有很高的灵敏度,能够测定感兴趣组织中p-摩尔甚至f-摩尔数量级的配体浓度。③PET 经常使用半定量方法,但也可以使用绝对定量方法测定活体内生理和药理参数。④PET是一种无创伤性方法。⑤PET使用示踪量的PET显像剂,不会产生药理毒副作用。小动物PET是基于PET临床诊断技术发展起来的专门用于小动物的断层显像装置[5],除应具备上述优点外,尚具有以下主要特点和优点:①小动物PET扫描仪具有体积小,结构紧凑,超高空间分辨率[5],可对小动物进行精确PET 显像。小动物PET主要分为灵长类动物PET和啮齿类动物PET两类[4,6]。②小动物PET扫描仪价格较低,需要安装场地面积较少,研究单位能够承受。③使用啮齿类动物PET,可大幅度减少实验费用。首先,啮齿类小动物(如大鼠和小鼠)只需给予较少放射性剂量,可节约PET显像剂费用支出。其次,大多数人类基因与啮齿类小动物小鼠基因密切相关[6],使用小鼠进行分子生物学和遗传学实验占绝大多数,啮齿类小动物(如小鼠)价格便宜,选用小鼠进行PET显 像可以减少实验动物费用。此外,小动物PET已用于动物基因治疗和基因表达监测研究[7],转基因动物价格昂贵,小动物PET可对同一只转基因动物反复进行PET显像研究,可大大节约实验动物的数量和费用。④使用小动物PET,可以简化定量实验操作步骤,加快实验速度,减少实验误差,因为同一只小动物可在不同时间间隔内重复进行PET 显像[8]。⑤小动物PET为动物实验和临床研究提供了桥梁,因为动物显像实验结果可外推到人体[9]。尽管小动物PET已取得巨大发展,然而却面临以下的挑战:①空间分辨率[4,6,8]。空间分辨率是影响PET图像质量的一项重要指标。小动物PET的分辨率虽已达到1mm甚至小于1mm,但却降低了灵敏度。小动物PET准确的空间定位主要依赖于探测器固有空间分辨率,同时也受光子衰减、散射事件及随机符合等因素的影响,引入合适的校正方法也是将来研制小动物PET必须考虑的问题。另外,探头环直径减少,部分容积效应和溢出效应变得更为明显,不容忽视。②系统绝对灵敏度[4,6,8]。系统绝对灵敏度也是影响PET图像质量的一项重要指标。小动物PET分辨率的提高,却以牺牲系统绝对灵敏为代价,但系统绝对灵敏度必须至少达到临床PET同样的水平。灵敏度与探测器晶体厚度、探头数目、环数、光收集效率等有关。选用合适的探测器晶体和合适的图像重建方法可以提高系统灵敏度,但提高系统绝对灵敏度仍面对挑战。③药理学的限制[4,8]。为了提高小动物PET 系统绝对灵敏度,注射高剂量放射性药物是必要的,但会增加给予小动物体内的化学量,很可能会产生药理作用。④输入函数[4,6]。小动物PET绝对定量显像研究需要测定血液输入函数,要求反复抽取动脉血样,在大鼠中已有成功报道,但小鼠取血非常困难。⑤麻醉与动物无菌性[4,6]。在扫描过程中,动物一般需要麻醉以防止运动,但麻醉剂会影响心血管、呼吸及中枢神经系统,麻醉剂的选择和用量及麻醉的深度是必须考虑的问题[10]。另外,许多动物实验需要控制在无菌环境中,这也是必须考虑的问题。⑥感兴趣区的区分[4]。严格固定和摆位有利于确定动物的解剖结构和寻找感兴趣区。常规立体定位头罩可解决头部固定问题,但头部以外部位固定是仍需要解决的问题[4,8]。多种形式小动物显像装置的结合,如MicroPET/CT 或MicroPET/MRI[6]等,能解决解剖定位问题,但这些融合显像仪正在研究中。中国宠物医师网E
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c)U0@02 小动物PET分子显像的基本原理与小动物PETmwwx ~V0
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扫描仪的类型8A(G%YcT*i4j\0
]Y._5R^|!G2CU0小动物PET 显像可以从体外无损伤地、定量地、动态地测定PET显像剂或其代谢物分子在活体动物体内的空间分布、数量及其动态变化,从分子水平上获得活体小动物体内生化、生理及功能代谢变化的信息,为临床研究提供重要资料。小动物PET显像的基本原理与临床型PET 类似,其基本原理[9,11]为:主要利用医用回旋加速器发生的核反应,生产正电子放射性核素如15O、13N、11C、18F等,通过有机合成、无机反应或生化合成制备各种PET显像剂。显像剂经静脉注射、口服或吸入等方式引入体内定位于靶器官,正电子放射性核素在体内经β+ 衰变转变为一个正电子、一个中子及一个中微子。这种正电子具有一定能量,可在组织中运行很短距离（几毫米)后,与人体组织中的负电子发生湮没辐射效应,产生能量相等(511keV)、方向相反的两个高能光子。在湮没辐射的两个对应发射方向放置一对互成180º排列并加符合线路的探测器,所有探测器排列在360º圆周上形成环状结构的探头,利用正电子准直或光子准直方法在体外测定PET显像剂所产生的湮没辐射的光子。正电子准直有别于单光子发射计算机断层(SPECT)中对射线限速的机械准直。探头的多环结构,使得一次断层可获得几十个断层面。采集的信息通过计算机图像重建处理,可显示出靶器官和全身的横断面、冠状面和矢状面的断层图并可给出定量生理参数。小动物PET 显像需要PET 显像剂和小动物PET显像仪,现有PET显像剂(如2[18F]-2-脱氧-D-葡萄糖即FDG等)均可用于小动物PET显像,此外小动物PET显像必备的工作人员为PET化学师和分子影像学专家。20世纪80年代中期,哈佛大学Massachusetts总医院研制成功的PCR-1为最早小动物PET扫描仪之一[8],PCR-1出现,推动了世界范围内小动物PET扫描仪的研制。90年代初,首次研制成功的专用于灵长类动物的PET 扫描仪,包括日本Hamamatsu公司生产的SHR-2000型和美国CTI PET系统公司生产的ECAT-713型扫描仪,它们适于猴类和犬齿类动物显像[6]。尔后,英国Hammersmith医院与美国CTIPET 系统公司合作研制成功第一台专用于啮齿类小动物的小直径PET扫描仪RAT-PET[6]。从90年中期起,国外多个国家已研制成功多种专用型小动物PET扫描仪并用于动物显像。小动物PET扫描仪由探测系统、计算机控制床、衰减校正点源架、激光定位系统、计算机工作站及其他辅助部分组成,其中探头是扫描仪的核心,决定小动物PET的分辨能力和灵敏度。根据探测器设计原理,小动物PET扫描仪主要分为两类:一类是基于晶体型的小动物PET 扫描仪[2],如MicroPET R4和P4、MADPET、TierPET、Hammersmith RAT-PET、Sherbrooke APD-PET、YAPPET、SHR-7700、ANI-PET、ClearPET、A-PET 及TMAE-PET等[2,4,12～14];另一类为多线电离室型的小动物PET 扫描仪[2],如HIDAC-PET[2,4]等。目前,已推出商业机型有MicroPETR4、MicroPET P4、32-modulequad-HIDAC和SHR-7700[4],其中MicroPET 最受欢迎,并且2001 年UCLA 的Crump生物影像研究所又研制成功第2代动物PET扫描仪,即MicroPET Ⅱ,其绝对灵敏度为2.26%[15]。以上小动物PET 扫描仪各有千秋,应根据不同目的进行选购。中国宠物医师网f&hK5CDE O2O
K8w1L8jw zg.E03 小动物PET显像在生物医药学研究中的应用^ b5g
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3.1 应用于生物医药学实验室 小动物PET的发展引起了生物学家、医学家和药物学家的强烈兴趣,目前,世界许多国家和地区(包括中国的台湾和香港)已购买或准备订购小动物PET扫描仪。小动物PET扫描仪价格较高,每台约40万～70万美元,生物医药学家之所以愿意购买,原因如下:第一,可获得动力学资料[2,8]。PET获得的时间-放射性活度动力学资料完整地描述了单个动物体内生物分布及配体-受体结合动力学,消除了动物间的误差,提高了所获动力学资料质量,而且减少了实验动物的数量,在费用和伦理问题上更令人接受。Hume等[16]用小动物PET对10～12只大鼠进行显像,就能获得多巴胺转运蛋白两种配体的饱和动力学曲线,这些资料足以建立生物数学模型,估算体内解离常数。第二,可定量测定全身生物分布[2,8]。小动物PET可以在不同时间间隔内快速定量测定动物全身或局部生物分布资料,避免了在不同时间点处死动物,经解剖获取靶器官。第三,提供无创伤性的分子显像方法[2,8]。无创伤性方法是小动物PET最大优点,可以反复对珍稀动物诸如病变损伤的珍稀动物或转基因动物等进行活体显像。第四,可验证动物模型真实性。小动物PET将PET技术的应用从对病人的临床诊断推广到对小动物科学实验,是验证动物模型真实性和评价药物疗效的先进工具,是连接实验科学和临床科学的桥梁[9]。小动物PET通过对特异性PET药物参与活体代谢过程进行分子显像,可从分子水平上研究活体动物体内生理生化和功能代谢变化,也可研究临床前药代动力学和药效学。在生物医药学研究中,大量实验需要以小动物模型来模拟人类的生理生化过程,用于研究人类的生命现象和疾病起因及评价药物临床前药理,小动物模型是否能真实反映人体内生理生化特性,需要将动物实验结果外推到人体,这是一般方法难以准确判断的问题。若将小动物PET测定的生理生化特征性影像指标与人体疾病过程中PET显像测定的指标进行比较判断,便能很好解决这个问题。 e+GP L7TM0
b4] _p(\X0E:v x03.2 代谢显像 小动物PET代谢显像主要集中在葡萄糖代谢显像。高分辨率小动物PET,如同临床PET用于测定人心脑葡萄糖代谢一样,已广泛用于动物心脑葡萄糖代谢显像研究[6]。例如,MicroPET可用于大鼠脑神经元激活和重塑形的半定量研究以及大鼠脑创伤性损伤后葡萄糖代谢变化的定量研究;小动物PET也用于测定缺血性梗死大鼠和小鼠模型的葡萄糖代谢和心肌血流(用13N-氨水测定)变化,研究缺血梗死性心肌血流与葡萄糖代谢的关系;SherbrookeAPD-PET对大鼠进行门控心肌代谢显像研究;ECAT-713结合FDG无创伤性定量测定小鼠血液时间-活度曲线,用于评估FDG 模型常数[17]。中国宠物医师网#P&R8R2B9^0rBO C5{
&],BbBJ,H!}`03.3 受体显像 小动物PET结合正电子核素标记配体可用于各类受体显像,目前研究最多的是集中在多巴胺能神经递质系统。多巴胺能神经递质系统正电子显像剂,包括反映多巴胺合成的显像剂(如18F-m-酪氨酸和18F-L-多巴)、D2受体显像剂(如11Craclopride、18F-N-methylbenperidol和18F-氟乙基螺哌隆)及多巴胺转运蛋白显像剂(如11C-CFT、11CWIN35428和18F-β-FP-CIT)。这些显像剂在动物脑纹状体中有高度摄取,已用于猴脑、大鼠脑和小鼠脑的小动物PET 显像研究。例如,Nikolaus等[18]用18F-N-methylbenperidol结合TierPET显像获得的大鼠纹状体多巴胺D2受体结合放射性值与放射自显影术测定值密切相关,他们也发现6-羟基多巴胺诱发的帕金森病大鼠模型双侧纹状体放射性浓度明显增加,并且损毁侧的同侧比对侧更显著[19]。另外,Thanos等用11C-raclopride结合MicroPET 显像对小鼠脑神经化学进行了研究[20]。中国宠物医师网$}
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_#j]Df9})G)b03.4 肿瘤显像 小动物PET用于肿瘤显像具有一定优点。首先,研究移植原发性肿瘤模型非常简单,因为肿瘤可移植在远离主器官位于动物的大腿、肩和背部等部位,在这种情况下,可对部分体积效应进行直接校正。其次,实验动物间的变异可以有效消除,每只动物自身可作对照。此外,PET 能对动物进行全身显像,可观察和监测肿瘤转移。各种肿瘤正电子显像剂如FDG、FLT和FET等[21]均可用于动物肿瘤显像,正电子标记抗体和抗体片段也可用于肿瘤放射免疫PET显像。小动物PET是评估抗体片段体内动态变化及肿瘤定位的重要工具。:AM)M;h}5G2G.~_ bW0
:EPw(H9s f0m03.5 基因表达显像 基因表达PET显像主要包括反义PET显像和报告基因表达PET 显像两种方法[7,23]。利用正电子核素标记某一特定序列的反义寡脱氧核苷酸(RASON)作为PET显像剂,在体内与相应的mRNA片段结合,通过小动物PET显像,以反映目标DNA 转录情况。反义PET 显像是一种内源性基因表达显像,在这两种方法中尤为重要,但反义显像难度更大。报告基因表达显像又称转基因表达显像,其研究进展远比反义PET显像迅速。该显像系统必须具备两个基本要素,即PET报告基因和PET报告探针。PET报告探针常用的标记正电子发射放射性核素为124I和18F,其中以18F最为常用。报告基因表达PET显像技术又分为酶介导报告基因表达PET显像系统和受体介导报告基因表达PET显像系统两类。对于酶介导PET 显像系统,其报告基因表达的蛋白质产物是一种酶,报告探针是正电子放射性核素标记酶底物,其作用机制为底物在特异性酶作用下发生脱胺或磷酸化作用。目前主要研究的PET报告基因是胞核嘧啶脱胺酶和单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶(HSV1-tk),前者研究较少,后者研究较多。用于HSV1-tk显像的标记底物有两类:尿嘧啶核苷衍生物和无环鸟苷衍生物。最常用的PET报告探针为5-124I-2'-fluoro-2'-deoxy-1-β-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil(124I-FIAU)、9-[(3-18F-1-hydroxy-2-propoxy) methyl]guanine(18F-FHPG)和9-(4-18F-3-hydroxymethylbutyl)guanine (18F-FHBG)[7]。对于受体介导PET显像系统,其报告基因表达的蛋白质产物是一种受体,报告探针是正电子放射性核素标记配体,其作用机制是受体-配体特异性结合作用,经基因转导可明显提高靶细胞特异性受体的表达。目前研究最多的是多巴胺D2受体(D2R)报告基因,最常用的报告探针为18F-fluoroethylspiperone(18F-FESP)[24]。若将感兴趣基因与PET报告基因偶合在一起制作串联双基因,在同一启动子作用下,感兴趣基因和PET报告基因就可在同一水平上进行表达。特别令人感兴趣的是利用相同的启动子和不同的腺病毒载体,将等量滴度的分别携带D2R 报告基因和HSV1-tk自杀基因的两种不同腺病毒载体同时给予同一只小鼠,这两种基因在小鼠体内可同时进行表达,并且这两种不同基因表达量高度相关[25]。这样,一系列感兴趣基因的表达可用同一种PET报告探针进行监测,因而报告基因表达PET显像可成为一种通用的显像方法。报告基因表达PET显像主要应用于重复、无创伤地测定报告基因或感兴趣基因表达的部位、表达量及表达持续时间,也可用于基因治疗和转基因动物基因表达的监测。但是,目前报告基因表达PET显像研究大多是在小鼠体内完成的。小动物PET对小鼠体内感兴趣基因和PET报告基因表达显像的研究,为进一步用临床型PET研究病人体内基因表达显像提供了重要实验平7ID C6I#l V
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3.6 药物研究 小动物PET应用于药物研究包括诊断PET药物和治疗药物(含中草药)的临床前药理研究,是研究临床前药效学和药动学的先进工具,连接临床前药理和临床药理的桥梁。小动物PET是研究PET药物的先进工具,可测定PET药物在动物体内生物分布和药物代谢动力学,也可评估体内吸收剂量和临床前放射药理活性,实验中应用最多的动物是实验小鼠。将PET药物引入小鼠体内,用啮齿类动物PET对其进行动态显像,可获得各器官时间-放射性动态体内生物分布资料。小鼠或人体内吸收剂量可由S-因子和小鼠体内生物分布资料估算[26]。由于左心室取血获得的血液时间-放射性曲线与通过对肝脏进行显像获得肝脏感兴趣区的时间-放射性曲线高度相关,因而肝脏感兴趣区的时间-放射性曲线可用于估算血液时间-放射性曲线[17],从而结合药代动力学计算程序如3P97可用于估算药代力学参数[26]。此外,建立各种动物模型,用小动物PET可以研究PET药物的作用机制及评价PET药物显像效果,并将动物实验结果推广到临床,为进一步用临床PET评价PET药物临床药动学和临床药效学提供重要实验依据。但是,小动物PET不能区分动物体内的原型PET 药物及其代谢物,必须借助其他仪器如HPLC、GC-MS及HPLC-MS等才能准确测定动物体内PET药物代谢转化过程中所产生的各种代谢产物,这是小动物PET在药物研究中的最大缺陷。小动物PET应用于治疗药物(包括中草药)研究,是小动物PET最具吸引力和最具前景的领域,也是一个崭新领域。小动物PET应用于药物研究,主要有直接法和间接法两种方法[9]。直接法即用正电子核素如11C或18F直接标记感兴趣的药物,用小动物PET动态地测定动物体内生物分布,研究临床前药物代谢动力学及药物作用机制。这种方法可以评估药物在动物体内作用部位、药物浓度和时间过程,研究药物在动物体内以受体、酶、离子通道、抗原和核酸作为靶点的作用机制。例如,Trastuzumab(一种抗HER2/neu单克隆抗体)是一种有潜力的肿瘤化学治疗剂。用MicroPET结合正电子核素86Y标记Trastuzumab对荷卵巢癌小鼠进行动态显像,可获得86Y-trastuzumab在荷瘤小鼠体内生物分布和药代动力学参数,为进一步进行临床药代动力学研究提供了重要资料[27]。直接法的主要缺点在于必须花大量时间用正电子核素标记感兴趣药物。间接法即不直接标记感兴趣药物,而是用现有的PET显像剂间接研究药物作用机制和评价药物疗效。这种方法不需要花时间合成正电子核素标记感兴趣药物,但不便于测定药代动力学参数。间接法又包括采用常用结合型PET显像剂研究法和采用常用血流灌注或代谢型PET显像剂研究法。前一种方法可通过测定感兴趣药物与PET显像剂竞争结合靶点而进行体内显像筛选药物,也可测定感兴趣药物在体内转运及其亲和力,并且只用一种PET显像剂就可测试评价与某一靶点作用的大量感兴趣候选药物。后一种方法可采用常用血流灌注或代谢显像剂(如13N-氨水、FDG 和FLT 等)测定药效学作用,如定量测定血流量、葡萄糖代谢及细胞增殖等,以评估药物疗效。直接法和间接法各有优缺点,应根据不同应用目的选用。此外,小动物PET在药物毒副作用、药物给药途径、药物剂量学、药物立体结构和动物种类对药物疗效影响、移植治疗监测及中医药学研究中的价值有待于进一步探索。rt{D.|]4\e
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2j G3G`f#w6W$Vj4QH04 结束语中国宠物医师网'e-]lc'Ep,]?!k9X
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各种小动物PET已用于生物医药学研究,是实验科学和临床科学的重要桥梁,小动物PET将来的发展主要体现在以下三方面:首先,小动物PET扫描仪的性能有待于进一步提高。降低小动物PET扫描仪复杂性和造价,优化计算机软件,研制出低价、高性能、高分辨率、使用更方便的微型小动物PET扫描仪是将来发展的必然趋势。其次,研制和推广融合型小动物PET扫描仪是将来的发展方向。目前,临床型PET/CT已广泛用于各种疾病诊断研究,高分辨率解剖型显像仪MicroCT或小动物MRI与功能型显像仪小动物PET两机融合于一体已成为可能。此外,小动物PET在生物医药学研究方面将得到更广泛的应用。小动物PET将用于直接获取活体动物实验资料和人体四肢病变资料(如诊断关节炎等),是研究药物药效学和药动学以及体内药物筛选的高通量工具之一,在中医药学和基因组后生物学研究中的价值将越来越受到人们重视。目前,小动物PET已在国外得到飞速发展,期望国内有条件单位争取早日引进,推动我国分子影像学和药物研究的发展。&A-b]+N_g0
