猫泛白细胞减少症病毒的分离与鉴定
中国宠物医师网:R
c2Ek&f A,Mo+s Q
摘要：用继代猫肾细胞（FK81）从疑似猫泛白细胞减少症的急性期粪便中分离到1株病毒，经血凝及血凝抑制试验、免疫荧光抗体试验、免疫电镜观察、细胞病变特征和中和试验鉴定，证明所分离的病毒为猫泛白细胞减少症病毒，命名为BJ－JB－8。中国宠物医师网Gn6W7V"\7g7Fy'Y4{p
R _O8\|d,T0关键词：猫泛白细胞减少症病毒；猫肾细胞；分离鉴定&F1V2M`QbtF0
?0^XeQ ?0hl9?0猫泛白细胞减少症又称为猫瘟热，是由猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus, FPV）引起的猫及猫科动物的一种急性高度接触性传染病。临床表现为发热、呕吐、腹泻、脱水及白细胞严重减少和肠炎。FPV在自然条件下可以感染猫，也可以感染狐、狮、豹和浣熊等珍稀野生动物，给养猫爱好者和野生动物保护造成巨大威胁。中国宠物医师网7lH&H7DV
中国宠物医师网"V }1La(t
J0m
该病原在分类上属细小病毒科、细小病毒属。病毒颗粒呈二十面体立体对称，无囊膜，直径为20～24nm，核衣壳由32个壳粒组成，每个壳粒为3～4nm。核酸类型为单股DNA，分子量约为1.7×106。中国宠物医师网/g _ h7f9k bG2[i3L#c
6X0jM G/I3y{}0该病毒1975年（Bilin）和1964年(Johnson)首次分别从猫和貂的病例中分离到。该病毒分布于世界各地，我国很多省、市也发生疑似猫泛白细胞减少症的疾病。国内学者也从患病的猫中分离出了多株病毒，并进行了多方面的研究。我们在2005年12月收集到1例疑似猫泛白细胞减少症的急性期粪便，用FPV（抗原）金标试纸条检测为强阳性，该粪便经处理后接种到FK81单层细胞上，成功地分离到1株病毒，经鉴定为FPV，命名为BJ－JB－8，现将结果报告如下。Tsrc#V1nE0
i"S`3_$fH?0一、材料与方法)A|0R"?3tH&X0
中国宠物医师网y M:c[9k
（一）材 料中国宠物医师网 `%h vh-Vt&X maI4d
中国宠物医师网2W[+aOn"zo
A
继代细胞有猫肾细胞（FK81）、水貂肺细胞(CCL-64)和非洲绿猴肾细胞（Vero），抗FPV标准血清，均由北京京霸生物技术开发研究公司引进；免疫荧光抗体购自美国；金标FPV试纸条购自韩国；一次性培养瓶、DMEM和小牛血清购自国内代理公司。中国宠物医师网F*\$Xe @%[q~
9e*fN,uL x
L0（二）病毒分离中国宠物医师网c#PZ/Qps a,vM~4|Ui7a+K
中国宠物医师网;[r#m__K:S
a
收集的猫粪便用DMEM作1:5稀释，离心取上清液，再经0.2um滤膜过滤除菌，-80℃保存备用。取除菌的样品接种于FK81细胞悬液中，5ml细胞悬液中加入2ml样品，置37℃含5% CO2温箱中培养，24小时后换成维持液，继续培养，逐日观察细胞病变（CPE）。
l6]r k`:WpN0
b}i e \0（三）血凝试验
JgA6SWw7\
}Z6L0
中国宠物医师网Vee"v5?9Qay#v
将分离的病毒液在96孔V型微量血凝板上用生理盐水倍比稀释后，再分别加入等体积的1%猪红细胞悬液，轻微振荡均匀，置4℃，2～4小时后判断结果。中国宠物医师网
i q([:~/p
中国宠物医师网 K%S%x\$Gf
（四）免疫电镜观察!@ |
dUSqL0
7TQTn O}0 将传至5代的病毒反复冻融3次，以5000转/分离心5分钟，取上清液1ml与1:20稀释的抗FPV标准血清等量混合，37℃孵育1小时，置4℃过夜，次日以12000转/分离心5分钟，弃上清，沉淀物用磷钨酸负染后，电镜观察。2M+{%bv5vB0
中国宠物医师网/X _I-B c9`
（五）免疫荧光抗体试验kF4BT'A k b H(P0
中国宠物医师网(wHs;M+y-Q Z
将分离病毒按常规制成抗原片，用引进的FPV荧光抗体染色，在荧光显微镜下观察结果。)G3lx,@ g4O!v0
中国宠物医师网?bmz2a0u8K)J
（六）细胞敏感性试验中国宠物医师网v2?]Z H8X e\
中国宠物医师网 ZT
h1B7lk@5F
在FK81细胞上传至5代的病毒，反复冻融3次，5000转/分离心5分钟，收取上清液，1:10稀释，分别接种FK81、CCL-64、Vero和鸡胚成纤维细胞，37℃培养，逐日观察CPE。'J/?&?5N!a&D&x0
中国宠物医师网'Z_{M2|
（七）中和试验中国宠物医师网B1B(gt&? Hj%X)@
B2e)yH
Mb&Wgj
kz0 采用稀释血清固定病毒的方法，在96孔微量细胞培养板中进行，即连续2倍稀释抗FPV标准血清，稀释到1:1024，每个稀释度以100ul的抗FPV标准血清与100 ul（100TCID50/0.1ml）分离病毒株等量混合，振匀，37℃作用1小时，然后按50ul/孔加入约1×106个FK81细胞，置37℃含5% CO2温箱中静置培养，逐日观察CPE。 O/J:K)M TX5A!P0
中国宠物医师网*CQ%k n(nv6?
（八）金标试纸条检测FPV抗原2L2p?2e4f ]0
0D;P*Cl/^0A_$y0 将培养的病毒冻融3次，5000转/分，离心5分钟，取上清液，按操作说明书滴加在试验孔内观察结果。中国宠物医师网 C#|gU+Rg C
中国宠物医师网*b7X]
I|*B)S
二、结 果中国宠物医师网Sw$\ m'u"_ZzF W(b
中国宠物医师网oz"B q&nT q
（一）病毒分离t4g;p9i vG
r0
中国宠物医师网
ch,PR0y8k
收集的疑似猫泛白细胞减少症急性期粪便（FPV金标试纸条检测为强阳性）处理后，取上清液接种FK81细胞,3天后，FK81细胞发生轻微病变，初期可见细胞单层表面有少量细胞肿胀变圆，逐日圆细胞和固缩死细胞增多，到第5天，整个单层细胞脱落。分离的病毒传至3～5代，病毒滴度稳定，细胞病变出现时间缩短。FPV的细胞病变特征见图1。r*|?#?k0
&UWf%x&C0
Bu+{\9l0
C$I\Qvod
g I"D6\0
;T+~Jno+h@0
0YaY Hm3y0图1 1.FPV感染FK81细胞的CPE；)wmQ*|bD0
中国宠物医师网OA uZ T9]
2.正常FK81细胞中国宠物医师网,h[$Arp Rh L/^
中国宠物医师网Cf `2PCo0Py
（二）细胞敏感性试验中国宠物医师网ByR
i[|+T
中国宠物医师网(?$D,Xq6e5G.C2i$f/~.s4O W
分离病毒株分别感染FK81、CCL-64、Vero和鸡胚成纤维细胞后5天，细胞病变见表1。5rM q7h5L9tv+q!} {0
KeMk7{d0表1 分离病毒株在不同细胞中的敏感性4u
j*V6c4yL4Q-l0
中国宠物医师网
IMT-E(D%l:P9s
细胞中国宠物医师网;F,w x
@|!Fz%@
r#o8l rZ d0时间（天）中国宠物医师网+A$bgKx
中国宠物医师网R W(@9t.m
FK81 CCL64 Vero 鸡胚成纤维细胞中国宠物医师网)YvZ:sObmH[I
中国宠物医师网,nFVl(imWD
2WR-C*U;b"S0
中国宠物医师网XN W]2CE
3&T%^2x{z0fi\y0
7k0T1W^xV*@'~04 w@5s/y-J-k0
ny x
e$b,e5j051f
b9I2UpE
u(Y0
#wo`0z0x u0+ + － －中国宠物医师网gXT6iX
'yZy:v(@&H[6N0++ ++ － －中国宠物医师网9N#`E"v2]
中国宠物医师网 G;S i
m,x$Avav
+++ +++ － －(\&n/L:pShW o,J0
E0H7a(HR
W0脱落 脱落 － －中国宠物医师网/ww6@a P#c5?.fZt:l
中国宠物医师网9Y'f
IS r{.JP
FK81细胞接种病毒后2天，单层细胞上浮有少量圆细胞，胞浆中可见少量圆颗粒，细胞轻微肿胀，3天后细胞病变进一步发展，4～5天大部分细胞变圆，开始脱落。CCL-64细胞的病变及特征同FK81细胞。而Vero细胞和鸡胚成纤维细胞无CPE。c0F.PQ iJr8PKL0
y6r~$J ~.A6o0 （三）血凝及血凝抑制试验中国宠物医师网{:CzMa)f[
中国宠物医师网u$e@2^ r'sp
血凝试验见表2。血凝抑制试验结果表明，抗FPV血清能抑制JB－BJ－8株对猪红细胞的凝集作用，其血凝抑制效价为1:5120。9Q3z Ua(~3N E0
H+g n*`*W1oD6H0表2 病毒感染不同细胞的血凝试验~!V!ZCl Kc#A$j H0
%liRI|A0细胞中国宠物医师网 D}x [2|9gg(BW
JMW-a y*^ u@FxV,g0稀释度2A z^Ga0
1H;z
th$i0FK81 CCL64 红细胞对照gmniy1b*]4v0
-QD$Y J"Ii7S01:8aW1]+L;`m7aj0
中国宠物医师网0aC+c1ofKV\
1:16Gv8?/C6X0
u,UtP-Ybl,Z01:32中国宠物医师网%eK O$P5_f p n~
%C|2jM!t01:64v1XT0I"D7{`0
中国宠物医师网r f ^-|&Ey X
1:128中国宠物医师网Bz't6v"I8?g:T p/~9U
;n }1[&b/g%}0S01:256中国宠物医师网opZ`7xbb
中国宠物医师网 P6C+n] D,b]
1:512+xXU%o\2eF C0
中国宠物医师网2h}zc6Y F5@\#H
O
1:1024bYWz4`.^K?0
]e%b
|
e,H_01:2048+|nj%t.A MYSV0
中国宠物医师网5uROp$r
++++ ++++ －(Vh'D5mJ:RH"Hr0
中国宠物医师网uf
qF&|
++++ ++++ －中国宠物医师网)@9?9AfI QVm4g
*@K A!G Azq0++++ ++++ －中国宠物医师网n-j9BP/W{e
t
.`4f7GI3b;TL?Vi_r0++++ +++ －中国宠物医师网D$e$u
y-R
An ~^a M*Ay r!o0++++ ++ －中国宠物医师网"{9Z.O1r ?+] XS2f-B
中国宠物医师网D
u S9n*w.n9~S%W`#c
++++ + －,R6Y#L/ff'[5i#kl0
中国宠物医师网 ie)v7v1Q&p d
+++ － －中国宠物医师网|fuE!PNp
中国宠物医师网|~i)W*d*c
+ － －中国宠物医师网%eAA.J!Bl
中国宠物医师网G q!Up0Blo2x^S
－ － －中国宠物医师网7nCT]C U t `k
/V'}#C y
i[9o z*@-\0 用分离的病毒株接种FK81细胞培养至第5天，约90%的细胞出现CPE时收集病毒，制备免疫电镜，观察到大量圆形的实心和空心病毒颗粒，病毒颗粒直径为20～22nm(见图2)。p9\
m3Vu*f']0
'u
uD9y4B0L }O0h0
,wW6Jcc:X%b0
中国宠物医师网#PW3l V-A
图2 免疫电镜负染结果(65000×)中国宠物医师网@&GH"jF
中国宠物医师网$b iceVCMz-MI
（五）金标试纸条检测$MY @Z};f+U0
r&ImP2oXq0 将分离的毒株用FPV金标试纸条按说明书进行操作。实验区(T)出现明显的1条带，呈强阳性结果(见图3)。中国宠物医师网7X;H `;I3D*Q
中国宠物医师网W`,NHb,`V8q:~!H
6_ sFX8e,u(t(C0
中国宠物医师网
hZ(i&L5K-c;N
图3 金标试纸条检测结果中国宠物医师网9S7},|8U@fB @W]
中国宠物医师网X
X)f/E wW.VG1J
（六）免疫荧光试验中国宠物医师网)l0P;r4a\Rw
~6wD SYeepo
V.S0 经染色后的细胞在荧光显微镜下可见核膜浓染(见图4)。中国宠物医师网:Cl6HMxY"w
9csX.E
Aa+HI!S%X0
中国宠物医师网.HP!u2vQ-E&d,]:F
Ks;~(B8a @sp0图4 免疫荧光染色结果中国宠物医师网m\q/U6Vy
n0` B5S b#}n H#m0 （七）中和试验F,e
s"dx)i%| Puj0
中国宠物医师网zLc6{u c
结果表明，用抗FPV标准血清能中和所分离的毒株，其中和效价为1:256。中国宠物医师网 \]!Fj8R6p9k\T
中国宠物医师网rlxGa#R8I
三、讨 论中国宠物医师网 m/Hk2e3[]A*kl8X
%c t {8ci.} H*r0 据报道，FPV不能在鸡胚成纤维细胞中增殖，而能在多种猫源细胞中增殖，也能在水貂和雪貂组织细胞中增殖。根据FPV在猫源性细胞和水貂组织细胞内增殖的特性，我们用传代FK81和水貂肺细胞（CCL-64）均能增殖FPV。我们用标本与细胞共培养的方法进行初次病毒分离，所分离用的标本为急性期的排泄物并盲传3代，提高了病毒分离的成功率，但接种的病毒浓度、细胞种类及其接毒条件可能影响分离出病毒的可能性，而我们用FPV金标试纸条检测出强阳性的标本，这也是病毒分离成功的条件之一。中国宠物医师网Uq,d1eR/m
I9R*D
Y i c-Snq [0 分离的毒株经免疫电镜观察，可见直径为20nm的圆形病毒颗粒，有实心和空心两种粒子；免疫荧光可见细胞核浓染，中和试验可被特异的标准血清所抑制；在4℃条件下能凝集猪的红细胞，血凝性较好；用进口的FPV金标试纸条检测到抗原强阳性；从上述结果分析，我们分离的病原体为FPV，符合文献报道的特性。`s?:k,Lz!G0
中国宠物医师网Eh
|d)@;o Q/I
本病毒的分离成功将为我国FPV的病毒库增添了1株病毒，同时在疫苗的开发研制、抗血清的制备、变异株的研究等方面又提供了1个种源。/v;dZx0D#m7[0
中国宠物医师网8b v{6h!n
付少才1 陈万荣1 周珍辉2 周育森37M9pV
r5n0
中国宠物医师网%G4?l#K
V2r
1北京京西宠物医院中国宠物医师网2DkWXT Hlu'B0EL
中国宠物医师网&es\M ?)C7Ual3[
2北京农业职业学院中国宠物医师网+Pp j:Y|2^ V*\
,d"T&rJWr3B/g03军事医学科学院微生物流行病研究所中国宠物医师网-H
f { ^Y
( 0 B )
( 0 B )
( 0 B )
( 0 B )
( 0 B )
