铅引起细胞急性死亡的途径
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摘要：以不同质量浓度的铅（10、20、40、80 mg/L)作用于Wish细胞3、6、12、24 h，探索了铅对细胞急性死亡的影响。结果表明，10 mg/L的铅对Wish 细胞未呈现明显的毒性；40 mg/L的铅作用于Wish细胞24 h，细胞出现最大的凋亡峰；80 mg/L的铅使Wish细胞出现了以坏死为特征的细胞死亡。铅导致细胞死亡可通过2条不同途径：一个途径为一定剂量的铅通过启动细胞内的凋亡程序，出现以细胞体积缩小、胞质浓缩、DNA琼脂糖电泳呈梯状图像、流式细胞仪检测出现明显凋亡峰为特征的细胞凋亡；另一个途径是在铅质量浓度过大时，导致细胞体积增大、胞膜破损、DNA琼脂糖电泳呈模糊一片、台盼蓝染色法检查死细胞的比例大而流式细胞仪检测凋亡细胞少为特征的细胞死亡。2W6G^HLdH0
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关键词：铅； 细胞死亡； 细胞凋亡； 细胞坏死5l
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中图分类号：S8569 文献标识码：A 文章编号：1005-4545(2000)01-0006-049d5^}qU }f0
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U7AB ~+t4JZ$|0铅在工业上具有广泛的用途，但同时也易对环境和人畜健康造成严重危害。铅可引起细胞死亡，但铅引起的细胞死亡是细胞坏死还是细胞凋亡，或者是以哪个途径为主，目前还不清楚。本研究以人的羊膜细胞（Wish细胞）为实验材料，探讨了不同剂量的铅引起细胞死亡的途径，以为铅中毒的机理研究和防护提供依据。W pC[!HN0
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1 材料与方法中国宠物医师网t a3XYN&cR.?9mq;V
P8o7R*o+t&M3_01.1 材料 人羊膜细胞（Wish细胞），购自上海细胞所。台盼蓝、Tris－HCl、Rnase-A、溴化乙锭，Sigma公司;犊牛血清 (FBS)、乙酸铅、碘化丙啶,Promega公司;SDS、DMEM，Gibco公司。其他试剂均为华美公司产品。中国宠物医师网X cR,pP
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1.2 细胞培养 取指数生长期的Wish细胞,在含10% FBS的DMEM培养基中培养。当细胞长满单层后,换液,加入含不同质量浓度铅（0、10、20、40、80 mg/L）的不完全培养液（不含FBS），于37℃、5%CO2培养箱中培养 3、6、12、24 h。 P[SUYA.X$V!_2U0
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FX@4Q6pR01.3 细胞存活率测定 取Wish细胞(1.1×10.5/mL)接种于24孔培养板,每孔0.95 mL。当细胞长满单层后，吸去培养基，加入含不同质量浓度铅(0、10、20、40、80 mg/L)的不完全培养液，培养3、6、12、24 h。用台盼蓝染色法计算细胞的存活率。中国宠物医师网/^&lK a[9\+`
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1.4 形态学观察 指数生长期的细胞在各种不同质量浓度的铅液中染毒6~12 h后，用75%乙醇在4℃固定1 h，用含RNase(0.5 g/L)和碘化丙啶(50 mg/L) 溶液室温反应15 min，在荧光显微镜下观察。中国宠物医师网+zJ`&KAh~
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1.5 DNA琼脂糖电泳检测 将不同质量浓度铅处理的和对照组的4×10.6 个细胞离心,PBS洗2次,去除上清液,加入100 μL渗细胞裂解液(100 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,1%SDS,200 mg/L蛋白激酶K,pH7.5),混匀,于37℃ 水浴保温至液体变清亮，以12 000 r/min离心5 min,上清用等体积的苯酚、氯仿各抽提1次，加入2 μL RNase A(100 mg/L),再用等体积的苯酚、氯仿各抽提1次，在上清液中加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠和2倍体积的冷乙醇,于 -20℃沉淀过夜。于-10℃下,12 000 r/min离心收集沉淀，用70%乙醇洗1次,干燥,加入20μL TE(10 mmol/L Tris-HCl)。DNA在含0.4 mg/L溴化乙锭的1.0%琼脂糖凝胶上电泳,紫外灯下观察。中国宠物医师网+g#x(c0P q'Pl8\
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1.6 细胞凋亡数的检查 经铅处理的细胞调整至2×10.6/mL, PBS冲洗3次，300×g离心5 min,沉淀部分加入100 μL RNase(0.1 g/L)， 37℃温育0.5 h, PBS洗1次，1 500×g离心5min,颗粒部分加入0.5μL碘化丙啶工作液(200mg/L PI,1%Trition,0.9%NaCl),在4℃反应0.5 h。经PI染色的细胞用流式细胞仪(BectonDickinson,Mountain View,CA)测定，测定波长488 nm。数据由流式细胞仪的标准计算机程序（HewlettPackarol,Cellfit and Lysis）获得。中国宠物医师网9yT:IO d `{q0M
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2 结果中国宠物医师网r \~ t K zW*f@ V
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2.1 细胞存活率测定 见表1。当铅质量浓度在 0~10 mg/L时，细胞存活率大于96%；而当铅质量浓度达20~80 mg/L时,细胞存活率明显下降，且存活时间和剂量呈依赖关系。结果提示，小剂量的铅（10 mg/L以下）对细胞存活率无明显影响，而大剂量的铅可引起细胞死亡。中国宠物医师网y h![Gh [8[i/? C6i
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2.2 细胞形态学观察 10 mg/L的铅作用于Wish细胞，细胞的形态学无明显变化（与对照组相比）。40 mg/L铅作用于Wish细胞24 h，细胞体积明显缩小，核边缘化，胞膜完整，但有的发生皱折，有的出现大小不同的凋亡小体，呈典型的凋亡特征。当铅的质量浓度达80 mg/L时，细胞体积增大，有的细胞膜破裂，核不规则，呈现坏死的特征；与此同时，也有的细胞呈现凋亡的形态。v/\gNteg}0
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2.3 铅引起细胞死亡的特征 铅的质量浓度为40 mg/L时，呈现典型凋亡的DNA图像，即DNA “ladder”；而当铅的质量浓度达80 mg/L时，呈现坏死的DNA图像，即DNA电泳模糊一片(图2)。为了解凋亡细胞所占的比例，采用流式细胞仪对其进行了分析，结果见表2和图3。10 mg/L的铅作用于Wish细胞，未引起细胞明显凋亡，且凋亡的细胞数比对照组少；40 mg/L的铅作用于Wish细胞24 h时，凋亡细胞占的比例最大，且Wish细胞出现凋亡最大峰的时间与DNA琼脂糖电泳出现“ladder”图像的时间相一致。另外，用不含FBS的DMEM培养基培养一定时间，也可诱发细胞凋亡；当铅的质量浓度达80 mg/L时，可引Wish细胞发生坏死。3v k%G'Q5L#AO0
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3 讨论中国宠物医师网"^5~9t(K5PM
z2ph B"gg;u j6C0不同种类的细胞对铅有不同的敏感性。Hicks等[1]证实，鸡的软骨细胞在铅浓度低于100 μmol/L环境下培养24 h，细胞的存活率未受影响；而当铅的浓度在 300~3 000 μmol/L时，铅的毒性与剂量呈现明显的量效关系。鼠肝细胞在铅浓度为5～50 μmol/L中24 h，未发现中毒性变化；当铅浓度大于50 μmol/L时，则引起肝细胞发生明显病变[2]。神经胶质瘤C6细胞在10 μmol/L的铅作用6 d时，细胞存活率下降20.6%[3]。本试验表明，铅的质量浓度低于10 mg/L时,对Wish细胞未呈现明显的毒害作用；铅的质量浓度在20~80 mg/L时,细胞的存活率明显下降，且存在明显的量效关系。上述不同种类细胞中毒剂量的差别，可能与细胞在生理状态下所处的微环境有关。在生理情况下，微环境的铅量越高，周围细胞对铅的耐受性可能越强，反之亦然。骨骼是铅的蓄积器官，骨及软骨细胞对铅的毒性较不敏感，而神经组织在生理情况下，铅含量较低，因而神经细胞及胶质细胞对铅较敏感[4，5]。j+Xs*h e}0
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细胞死亡分为细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。细胞凋亡是一种在形态学、生物化学等方面不同于细胞坏死的细胞死亡模式。铅可引起细胞损伤，导致细胞死亡。多数学者认为，铅引起细胞死亡是细胞坏死，而有关铅引起细胞发生凋亡的报道尚少。本试验从细胞存活率、形态学、DNA琼脂糖电泳等方面观察了不同质量浓度的铅对Wish细胞的影响。结果表明，10 mg/L的铅对Wish细胞的存活率和形态学方面无明显影响；40 mg/L的铅使Wish细胞呈现细胞凋亡的形态学特征；80 mg/L的铅则导致Wish细胞呈现细胞坏死的形态学特征。同时，40 mg/L的铅组DNA琼脂糖电泳呈现典型的“梯状”凋亡图像，而80 mg/L的铅组DNA琼脂糖电泳出现典型的模糊一片的坏死图像。由此说明，铅引起的细胞死亡是通过2个不同的途径：细胞凋亡和细胞坏死。中国宠物医师网-mAnzI0q
'f0X Ns!?3SIn8\9zX0为了解铅引起的细胞凋亡的量效关系，我们采用流式细胞仪对其进行了检测。结果表明：（1）正常细胞在不含血清的培养基中培养一定时间，也可引起细胞凋亡。这与McConkey等[6]的结果一致；（2）低于10 mg/L的铅处理Wish细胞，不但没有诱发凋亡，反而减少了细胞凋亡的发生，其确切机制尚不清楚；（3）以40 mg/L的铅处理Wish细胞24 h后，出现了最大凋亡峰（53.77%）；（4）当铅质量浓度增加到80 mg/L时，死细胞数显著增加，但凋亡细胞（21.25%）没有增加，反而明显下降，说明有一部分细胞死亡不是通过凋亡，而可能是通过坏死。由此可见，不同量的铅决定着细胞的不同命运，即低质量浓度的铅不会引起细胞发生急性死亡，只有当铅的质量浓度达到一定数量时才可引起细胞凋亡，而当铅的质量浓度进一步提高则可引起细胞发生坏死。%kx@$z q0
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总之，不同质量浓度的铅导致细胞死亡的途径是不相同的：一是通过启动细胞内的凋亡程序，促使细胞发生凋亡；另一是铅质量浓度过大时，直接引起细胞发生坏死。3N7N3y2tF!xh0
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李 萍1， 彭双清2（1.解放军军需大学 动物科技系， 吉林 长春 130062； 2.军事医学科学院 毒物药物研究所， 北京100850）中国宠物医师网0~ lp:^
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